Integrationsstellen-Analyse viraler Vektoren mit (nr)LAM-PCR

Die Identifizierung der vektorflankierenden genomischen Sequenzen erfolgt mit Hilfe der linearen amplifikations-mediierten PCR (LAM-PCR) wie in Schmidt et. al 2007 beschrieben. Optional wird auch die nicht-restriktive (nr)LAM-PCR angewendet (Gabriel et al. 2009 und Paruzynski et al. 2010).

Bei der LAM-PCR werden die flankierenden Sequenzen durch lineare PCR mit biotinylierten Primern, die homolog zu Sequenzen des Vektors sind (z.B. 3‘ Ende des retroviralen "long terminal repeats" (LTRs) des Vektors), amplifiziert. Die weiteren Schritte umfassen die magnetische Anreicherung der biotinylierten PCR-Produkte, Doppelstrangsynthese mit Hexanukleotid-Primern und Klenow-Polymerase sowie Restriktionsverdau mit verschiedenen Restriktionsenzymen (z.B. MluCI and MseI). Nach dem Restriktionsverdau werden Restriktionsenzym-spezifische Adapter (Linker Kassette), die einen für jede einzelne LAM-PCR spezifischen molekularen Barcode enthalten, an die verdaute DNA ligiert. Auch bei der nrLAM-PCR werden die flankierenden Sequenzen durch lineare PCR mit biotinylierten Primern vervielfältigt. Die weiteren Schritte umfassen die magnetische Anreicherung der biotinylierten PCR-Produkte und die direkte Ligation einer einzelsträngigen Linker Kassette, die einen molekularen Barcode enthält. Die ligierten PCR-Produkte können nun exponentiell mit biotinylierten Vektor- und Adapter-spezifischen Primern amplifiziert werden. Nach der magnetischen Anreicherung der biotinylierten PCR-Produkte erfolgt eine Reamplifikation in einem zweiten exponentiellen PCR-Schritt mit genesteten Vektor- und Adapter-spezifischen Primern.

Die (nr)LAM-PCR Produkte werden nach Vorbereitung der Proben für Hochdurchsatzsequenzierung (Illumina) im Regelfall mit dem MiSeq-Gerät sequenziert. Hierfür ist eine zusätzliche PCR mit speziellen Fusionsprimern, die die MiSeq spezifischen Sequenzier-Adapter enthalten, notwendig. Ein zusätzliches DNA-Barcoding wird hier verwendet, um ein hochspezifisches und qualitativ hochwertiges paralleles Sequenzieren von mehreren Proben in einem Sequenzierlauf zu ermöglichen.

Die Rohsequenzen werden nach ihrer Sequenzqualität (Phred 30) getrimmt. Nur Sequenzen, die korrekte Barcodes tragen (Linker Kassetten Barcode, Sequenzier-Adapter Barcode) werden mit eigens entwickelten Programmen analysiert (Arens et al. 2012 und nicht publiziert). Unsere bioinformatische Expertise erlaubt die weitere Analyse der Daten auch speziell nach Ihren Wünschen.

Publikationen:

1. Schmidt M, Schwarzwaelder K, Bartholomae CC, Zaoui K, Ball C, Pilz I, Braun S, Glimm H, von Kalle C: High-Resolution Insertion Site Analysis by Linear Amplification-Mediated PCR (LAM-PCR). Nature Methods. 4, 1051-1057, 2007.
2. Gabriel R, Eckenberg R, Paruzynski A, Bartholomae C, Nowrouzi A, Arens A, Howe SJ, Recchia A, Cattoglio C, Wang W, Faber K, Schwarzwaelder K, Kirsten R, Deichmann A, Ball CR, Balaggan KS, Yáñez-Muñoz RJ, Ali RR,  Gaspar HB, Biasco L, Aiuti A, Cesana D, Montini E, Naldini L, Cohen-Haguenauer O, Mavilio F, Thrasher AJ, Glimm H, von Kalle C, Saurin W, Schmidt M. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nature Medicine. 15, 1431-1436, 2009.
3. Paruzynski A, Arens A, Gabriel R, Bartholomae CC, Scholz S, Wang W, Wolf S, Glimm H, Schmidt M, von Kalle C: Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. Nature Protocols. 5, 1379-1395, 2010.
4. Arens A, Appelt JU, Bartholomae CC, Gabriel R, Paruzynski A, Gustafson D, Cartier N, Aubourg P, Deichmann A, Glimm H, von Kalle C, Schmidt M: Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites. Human Gene Therapy Methods. 23, 111-118, 2012.