(Off)-target Analysen zur Geneditierung
Genom-Editierung mittels Designer-Nukleasen ("Zinc-Finger-Nuclease", ZFN; "Transcription Activator-Like Effector Nuclease", TALEN; "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats" / Cas, CRISPR/Cas; "Meganucleases") ermöglicht die gezielte Einführung von genetischem Material in einen bestimmten Ort des Säugergenoms. Genom-Editierung konnte bereits überzeugende und vielversprechende Ergebnisse in der Grundlagenforschung und in klinischen Studien erreichen. Jedoch bestehen weiterhin Bedenken, dass die Verwendung von Designer Nukleasen zu unspezifische Modifikationen in genomischen Sequenzen außerhalb der Zielstelle führen kann ("Off-Target"). Diese zugeführten DNA Schäden stellen in vivo ein Restrisiko dar, das zu einer malignen Transformation führen kann. Da unspezifische DNA Schäden in silico nicht umfassend vorhergesagt werden können, sind praktische "Off-Target" Analysen unerlässlich (Gabriel et al. Nat Biotech 2011).
"Off-Target" Analysen können mittels (nr)LAM-PCR oder "Target Enrichment" Sequenzierung basierend auf der Sequenzinformation des genomischen Ziel-Lokus oder des verwendeten Donors (z.B. Plasmid, virale Vektoren) erfolgen (Gabriel et al. Nat Biotech 2015). In silico definierte "Off-Target" werden über Lokus-spezifische NGS PCR analysiert.
Referenzen
- Gabriel R, Lombardo A, Arens A, Miller JC, Genovese P et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nature Biotechnology. 29, 816-823, 2011.
- Gabriel R, von Kalle C, Schmidt M. Mapping the precision of genome editing. Nature Biotechnology. 33, 150-152, 2015.